Блестящий прогресс в открытии патогенов

Glowing Progress in Pathogen Discovery0

Фото Андреа Старр | Тихоокеанская Северо-Западная Национальная лаборатория

Бекки Хесс, биомедицинский ученый из PNNL, возглавляет проект OmniScreen для PNNL. В OmniScreen человеческие клетки светятся, если подвергаются воздействию патогена.

Glowing Progress in Pathogen Discovery1

Изображение Бекки Хесс | Тихоокеанская Северо-Западная Национальная лаборатория

Бекки Хесс из PNNL подвергла клетки человека воздействию зондированных бактерий, чтобы увидеть, какие клетки остались здоровыми (слева) или показали признаки повреждения (справа), что указывает на присутствие патогена.

Glowing Progress in Pathogen Discovery2

Анимация Кортленда Джонсона | Тихоокеанская Северо-Западная Национальная лаборатория

Используя машинное обучение, основанное на изображениях и цветах, алгоритм OmniScreen генерирует s-образные кривые уменьшения здоровых клеток, увеличения нездоровых клеток и скорости роста колоний бактерий.

Glowing Progress in Pathogen Discovery3

Фото Мишель Дэвисон | Тихоокеанская Северо-Западная Национальная лаборатория

Джанет Янссон из PNNL нашла простую, но эффективную среду для поддержания жизни экстрагированных бактерий: “почвенный чай.”

Предыдущий Следующий

Автор: Линн Редер

Newswise — любой биологический образец—например, грязь, вода или пища—содержит миллиарды бактерий. Лишь немногие из них вредны для человека или патогенны. Но эти немногие патогены могут означать разницу между надежными поставками мяса или салата, например, и вспышкой пищевого отравления—или, что еще хуже, пандемией.

Обнаружение смертоносных патогенов до того, как они нанесут удар, является одной из целей Агентства перспективных оборонных исследовательских проектов (DARPA). Агентство, входящее в состав Министерства обороны США, работает над разработкой новых технологий, которые помогут защитить Соединенные Штаты.

Несколько лет назад DARPA обратилось к исследовательскому сообществу с призывом “друг или враг”, чтобы выяснить, могут ли они быстро изолировать патогенные микроорганизмы из очень сложного образца, не затрагивая его основные функциональные возможности или фенотип. Тихоокеанская Северо-Западная Национальная лаборатория (ПННЛ), одна из трех организаций, решивших эту задачу, сформировала многопрофильную команду, обладающую научным опытом в области почвенной микробиологии и протеомики, биохимического синтеза и анализа данных.

Теперь, на полпути к проекту, который начался в 2019 году, команда совершенствует многообещающий новый метод, разработанный ими для обнаружения патогенов.

Метод, называемый OmniScreen, представляет собой сквозной конвейер для быстрого и эффективного выделения множества патогенных клеток в микробном сообществе. Система извлекает, исследует и экранирует тысячи клеток, чтобы выделить патогены в течение нескольких дней.

Примечательно, что OmniScreen также сохраняет образцы живыми.

Как правило, в биологических исследованиях образец замораживают, а затем “фиксируют” по мере необходимости для использования. Фиксирующий раствор может убить бактерию или, по крайней мере, изменить ее первоначальный фенотип. Преодоление этого препятствия имело решающее значение для PNNL, чтобы получить зеленый свет от DARPA для следующего этапа своего проекта.

— Мы действительно не были уверены, что это сработает. Часть риска, который мы выявили в самом начале, заключалась в том, что клетки могут не пережить зондирование”, — сказала Бекки Хесс, биомедицинский ученый из PNNL и руководитель проекта OmniScreen. — Это был один из критериев перехода ко второй фазе, и мы его выполнили.”

Грунтовка бактериального трубопровода

Первая задача состояла в том, чтобы извлечь бактерии, спрятанные в крошечных карманах образца почвы. Возглавляемая микробиологом и сотрудником лаборатории Джанет Янссон, команда попробовала несколько различных методов центрифугирования и остановилась на градиентах плотности. После того как образец вращался в нейтральном растворе, тяжелые частицы почвы оседали на дно, а более легкие бактерии всплывали наверх.

Первоначально метод давал миллион клеток за три часа—на два часа больше, чем первоначальная цель команды, над которой они продолжают работать. Янссон подчеркнула необходимость быстрого использования методов извлечения и анализа для DARPA.

Затем Янссон сортировала живые клетки от мертвых и окрашивала их, чтобы помочь с идентификацией при последующем фенотипировании. Этот протеомный анализ проводился в лаборатории экологических молекулярных наук (EMSL), пользовательском центре управления науки Министерства энергетики США, расположенном в кампусе PNNL-Richland. Мощные масс-спектрометры в EMSL отображали признаки, связанные с белками в каждой клетке.

Сравнение подвыборок до и после этапа протеомики подтвердило, что фенотипы все еще совпадают. Чтобы сохранить клетки живыми, а фенотип каждой клетки нетронутым, Янссон придумала простую, но новую питательную среду—почвенный чай.

“Когда мы погружаем почву в воду для ступени центрифуги, мы получаем что-то вроде чая”, — объяснила Янссон. — Он отлично работает, чтобы клетки не впадали в шок в новой среде.”

Травля и связывание патогенов

Бактерии-это разновидность микробов, которые могут содержать специфические особенности или химические вещества, делающие их патогенными. Райт использует информацию о микробных особенностях для построения химических зондов с аналогичными молекулярными признаками. Зонды служат приманкой, чтобы поймать бактерии, имеющие сходство с теми же признаками.

“Как рыба на крючке, как только микроб схватит зонд, вот и все—они застряли”, — сказал Аарон Райт, биомедицинский ученый из отдела биологических наук PNNL. Райт добавил, что разные цвета на зондах выдают их. — Мы знаем, какую рыбу поймали.»

Также в каждый зонд встроен репортерский механизм для целей слежения. В данном случае этим механизмом является флуоресценция. Как только зонд прилипает к белку, он начинает светиться определенным цветом в зависимости от патогена.

Затем Райт использует проточный цитометр для сортировки бактерий по одной клетке за раз со скоростью более 10 миллионов клеток в час. Прибор может определить, имеет ли клетка окрашенный зонд, а следовательно, патогенные признаки (или нет), и соответственно их сгруппировать.

“Мы можем создать всевозможные приманки, чтобы поймать различные типы патогенов”, — сказал Райт.

В лаборатории этот метод называется мультиплексированием; несколько зондов могут быстро и одновременно нацеливаться на несколько патогенных признаков. 

Скрининг на наличие больных клеток

После зондирования бактерии висят в пластиковой чашке Петри вместе с человеческими легкими, кишечником и иммунными клетками. Команда использует клетки легких и кишечника, потому что они являются наиболее распространенными путями заражения у людей. Под стандартным микроскопом видно, что здоровые растущие клетки сильно прилипают к блюду, но больные клетки теряют структурную целостность и начинают отрываться от блюда.

“Патогены могут ускользать от иммунных клеток и вызывать повреждение тканей легких или кишечника”, — сказал Гесс. — Когда клеточные соединения начинают разрушаться, это указывает на воздействие патогена.”

Поврежденные клетки тоже светятся.

“Это наш этап проверки,” сказал Гесс. — Если человеческие клетки выглядят здоровыми, то никаких патогенов нет. Если человеческие клетки теряют структурную целостность или светятся, это говорит нам о том, что патоген введен.”

Но эта проверка является трудоемким и громоздким шагом. Гесс сказал, что один анализ может дать 15 000 изображений. Даже с помощью автоматизированного микроскопа для определения патогенности, вручную просматривая все изображения, требовалось несколько дней. Это препятствие—то, где машинное обучение-третий сегмент конвейера—вступает в игру.

Скорость машинного обучения, обнаружения возбудителя

Енох Юнг, доцент Калифорнийского университета в Санта-Барбаре, разработал алгоритм машинного обучения для распознавания клеточных признаков, указывающих на больные и здоровые клетки.

Юнг задумал всезнающую идею для вызова “друг или враг”, работая над другими исследованиями в качестве приглашенного ученого в управлении национальной безопасности PNNL. Зная об опыте Гесса в иммунологии и синтетической биологии, он спросил ее: “вы можете заставить человеческие клетки сказать вам, если они больны?” Она сказала: “Да, я могу.”

Два ученых просмотрели ее коллекцию здоровых и нездоровых клеток, чтобы построить разреженный, помеченный набор данных для обучения алгоритма. Изучив эти изображения и цвет—или фенотип—патогена, алгоритм быстро просмотрел тысячи изображений и сгенерировал графики данных с тремя s-образными кривыми: здоровые клетки разрушаются (умирают), нездоровые клетки увеличиваются и скорость роста колоний бактерий. Чем круче кривая на левой стороне участка, тем агрессивнее возбудитель.

Увеличение пропускной способности

На первом этапе испытаний алгоритм OmniScreen за одну неделю разрешил 30 видов бактерий с 92-процентной точностью. Образец грунтовой правды, предоставленный DARPA, содержал 19 патогенных бактерий; OmniScreen обнаружил 17—гораздо лучше, чем ожидалось.

Вступая во вторую фазу проекта стоимостью 8,4 млн. долл. США, следующая задача команды состоит в том, чтобы решить пробу, содержащую почти в два раза больше бактерий, чем в пробе почвы, но из неизвестного источника.

Как и на первом этапе, Роберт Эгберт, синтетический биолог, фокусируется на решении критической интеграции инструментов и этапов процесса в рамках всей системы. 

“Мы постоянно работаем над передачей данных между техническими областями, — сказал Гесс, — но наличие слепого образца-это настоящая проверка системы.”

 

Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
Коронавирус-2